بررسي نحوه توليد و سم‌زدايي آفلاتركيسن

مقدمه
آفلاتوکسین‌ها گروهی از مایکوتوکسین‌ها با قدرت سرطان‌زایی، جهش‌زایی و کاهش کارآیی سیستم ایمنی، می‌باشند (Eatan &Gallagher , 1294; IARC , 1993) آنها از متابولیت‌های ثانویه سنتز شده توسط سویه های سم‌زای ASpergillus flavus , Aspergillus parasiticvs و Aspergillus nomius می‌باشند. آفلاتوکسین B1 با توجه به پتانسیل بالاتری که دارد، بیشتر مورد توجه قرار دارد.

رشد قارچهای مولد سم وآلوده شدن به آفلاتوکسین در بسیاری از محصولات غذایی دیده می‌شود (Wood , 1989). در صورت مصرف غذاهای آلوده به سموم آفلاتوکسین B1¬ و B2، این سموم به‌آفلاتوکسین‌های M1 و M2 متابولیزه می‌شوند و به درون بافت‌هاومایعات بیولوژیکی و شیر حیوانات شیرده ترشح می‌شوند (Zarba etal , 1992).

سویه‌های گونه‌های Bifidiobacterium , Lactobacillus , Lactococcus در تولید محصولات شیری تخمیری به عنوان استارتر کالچر و تولید کننده طعم و بو، به کار می‌روند نقش اصلی این کشت‌ها تولید اسیدهای آلی مثل اسیدلاکتیک در طی مراحل تخمیر است که سبب افزایش عمر قفسه‌ای محصولات می‌شود و هم محتویات حساس آنها را تغییر می‌دهد.

اگر شیر به آفلاتوکسین‌ آلوده باشد، احتمال تخریب مرحله تخمیر و تولید ترکیباتی با بوی تغییر یافته و ناخواسته را در محصول ایجاد می‌کند (Sutic & Banina , 1990).
اخیراً EL – Nezami و همکارانش (۱۹۹۶ , ۱۹۹۸) گزارشاتی ارائه داده‌اند مبنی بر وجود سویه‌های خاص لاکتوباسیل‌ که توانسته‌اند آفلاتوکسین‌ها را از محلول آبی جداکنند.

به علاوه سویه‌های خاصی از باکتری‌های اسید لاکتیک، توانسته‌اند آفلاتوکسین M1 را از شیر آلوده هم جداکنند (Pierides etal . ;2000). جداسازی آفلاتوکسین در نتیجه اتصال فیزیکی سم به دیواره سلولی یا ترکیبات دیواره سلولی است (Haskard et al. 2000 ; EL- Nezami et al. 1998 b).

همچنین جداسازی بعضی متابولیت‌های ضدقارچی مثل دی‌پپتیهدهای حلقوی و فنیل‌لاکتیک اسید و اسیدهای چرب هیدورکسیله شده از باکتری‌های اسیدلاکتیک، توانایی این گونه‌ها در بازدارندگی رشد قارچ‌های فاسد کننده مواد غذایی و مواد سم‌آفلاتوکسین را نشان می‌دهد.

آفلاتوکسین در ذرت
متابولیتهای سمی تولید شده توسط قارچها، که به عنوان مایکوتوکسین شناخته می‌شوند، در طی چند سال اخیر بسیار مورد توجه واقع شده‌اند. مایکوتوکسین‌ها امروزه به عنوان تهدید کننده‌های سلامتی در حیوانات شناخته شده‌اند که بیماری‌هایی مثل equine leukoencephalo malaci در اسب‌ها و Porcine edema را در خوک‌ها ایجاد می‌کنند. کاهش وزن، کاهش باروری و کاهش مقاومت در برابر بیماریها و حتی مرگ را به مایکوتوکسین نسبت داده‌اند. هیچ حیوانی نسبت به آنها مقاوم نیست ولی به طور کلی حیوانات پیرتر مقاوم‌تر از حیوانات جوان هستند.

بعضی مایکوتوکسین‌ها، مثل آفلاتوکسین در سلامتی‌اشان هم مخاطراتی را ایجاد می‌کنند. این مایکوتوکسین به عنوان یک موتاژن شناخته شده است. شناسایی آفلاتوکسین در ذرت می‌تواند باعث کاهش قیمت آن جهت بذر و یا حتی معدوم ساختن آن شود. آلودگی با مایکوتوکسین ها ارتباط مستقیم با تاثیرات جوی دارد.

قارچ Aspergillus Flavus تولید کننده آفلاتوکسین در محصولاتی مثل ذرت، پنبه‌دانه و بادام زمینی است. قارچ به طور معمول در طبیعت وجود دارد، اما مقدار آن در هوای گرم و خشک افزایش می‌یابد. آلودگی آفلاتوکسین در ذرت‌هایی بیشتر است که تحت شرایط استرس تولید شده‌اند.

بنابراین، خشکی، گرما، حشرات، کرم‌ها و استرس‌ ناشی از بارورکنندگی همگی منجر به ایجاد مقادیر بالای آفلاتوکسین در گیاه می‌شوند. تلاش برای ایجاد هیبریدهای ذرتی که به آلودگی قارچی مقاوم باشند و سم را در خود انباشته نکنند، وجود دارد، با وجود این هیبریدها بسیار مقاوم هستند ولی از تجمع سم به طور کلی نمی توان جلوگیری کرد. با کاهش استرس و مراقبت از حمله حشرات می‌توان در مقدار آفلاتوکسین کاهش ایجاد کرد (CAST , 1999) .

دمای Fْ۱۰۰-۸۰ و رطوبت نسبی %۸۵ (% ۲۰-۱۸ رطوبت در دانه‌ها وجود دارد) شرایطی بهینه برای تولید سم و رشد قارچ است.
از طرف دیگر مصرف‌ این محصولات به عنوان خوراک دام می‌تواند سبب ایجاد انواع دیگری از آفلاتوکسین‌ها (M1 , M¬۲) در شیر حیوانات شود. آلودگی ذرت به عنوان غذای دام و طیور و نیز ماده اولیه جهت فراهم کردن انواع گسترده‌ای از مواد غذایی و تنقلات، دارای اهمیت ویژه‌ای است و کاهش آفلاتوکسین به روشهای مختلف ضروری می‌باشد.

محصولات کشاورزی مثل ذرت، علوفه، بنشن، گندم و یونجه را می‌توان با سیلوکردن نگاهداری کرد. در بسیاری از کشورها محصولات سیلویی دارای ارزش غذایی بالاتری به خصوص برای دام‌ها می‌باشند. در کشورهای اروپایی مثل هلند، آلمان و دانمارک بیش از %۹۰ محصولات تولیدی در سیلوها نگاهداری می‌شوند. حتی در کشورهایی با شرایط عمومی آب وهوایی مناسب جهت خشک کردن مثل فرانسه و ایتالیا، حدود %۵۰ از محصولات خود را در سیلوها نگاهداری می کنند.

(wilkson et al.1996) . جهت تولید سیلویی با کیفیت بالا نیاز به مراحل تخمیر میکروبی مناسب وجود دارد. میکروارگانیسم‌های دخیل در مراحل تخمیر سیلوها، علاوه بر افزایش کیفیت غذایی محصول، قادر خواهند بود تا از رشد میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا و همچنین قارچ‌های مولد توکسین، جلوگیری کنند.

از آنجاییکه سیلوکردن محصولات بر پایه تخمیرهای متنوع اسید لاکتیکی تحت شرایط بی‌هوازی است، به کار بردن سویه‌های باکتریایی تولیدکننده اسیدلاکتیک که در سم‌زدایی و کاهش تولید آفلاتوکسین مؤثر هستند، منطقی‌تر به نظر می‌رسد. باکتری‌های اسیدلاکتیک محیطی و ساپروفیت موجود در محصولات، کربوهیدارتهای محلول در آب (WSC) موجود در محصولات را به اسیدلاکتیک و نیز مقدار کمی اسیداستیک تخمیر می‌کنند .

بر اثر تولید این اسیدها، PH مواد سیلو شده پایین آمده و رشد میکروارگانیسم‌های فاسدکننده، باز داشته می‌شود. باکتری‌های اسیدلاکتیکی که عمدتاً در سیلوها یافت می‌شوند. اعضای جنسی‌های لاکتوبا سیلوس، پدیوکوکوس، لوکونوستوک، انتروکوکوس، لاکتوکوکوس و استرپتوکوکوس می‌باشند. اکثر باکتری‌های اسیدلاکتیک موجود در سیلوها، مزوفیل‌اند، یعنی در دمای بین Cْ۵۰-۵ رشد می‌کنند که دمای بهینه رشد آنها بین Cْ۴۰-۲۵ می‌باشد. آنها PH سیلو را تا ۵-۴ پایین می‌آورند که این به گونه و شرایط محصول بستگی دارد.

همه باکتری‌های اسیدلاکتیکی هوازی های اختیاری‌ اند اما بعضی شرایط بی‌هوازی را ترجیح می‌دهند (Holzapfel and schillinger , 1992; Teuber et al. 1992) . جمعیت LAB در فاصله بین دروکردن و سیلو کردن محصول افزایش می‌یابد، که این بر اثر احیاء حالت‌های تاخیری است و نه اضافه کردن مصنوعی و تلقیح میکروارگانیسم. محتوای قندی و ترکیبات قندی موجود در محصول و مقدار ماده خشک و شرایط اسیدی و اسمزی موجود در سیلو، بر رشد و رقابت باکتری‌های اسید لاکتیک در تخمیر سیلویی تأثیر می‌گذارند.

فاز تخمیری سیلوها در زمانیکه شرایط سیلو بی‌هوازی شود، آغاز می شود که این عمل معمولاً بعد از چند ساعت از سیلوکردن که اکسیژن اتمسفری موجود در اعضای گیاه و فواصل محصول خارج شد، آغاز می‌شود و بسته به نوع محصول سیلو شده و شرایط سیلو، برای چند روز تا چند هفته ادامه پیدا می‌کند. در این فاز، لاکتو باسیل‌ها میکروارگانیسم‌های غالب سیلو هستند و PH سیلو را با توجه به عمل تخمیر خود بین ۵-۸/۳ پایین می‌آورند.

در فاز سوم که فاز ثابت می‌باشد که در صورت عدم دخول هوا به داخل سیلو، در بعضی مواقع به وجود می‌آید. در این حالت اکثر میکروارگانیسم‌های فاز تخمیری کاهش پیدا می‌کنند و تنها بعضی باکتری‌های مقاوم به اسید که قادر به تولید پروتئازها و کربوهیدراتازهای مقاوم به اسید هستند، مثل lactobacillus buchneri در مقادیر کم قادر به رشد خواهند بود.

در فاز چهارم که به محض قرار گرفتن سیلو در برابر هوا آغاز می‌شود، اسید آلی نگاهدارنده تولید شده توسط مخمرها و گاهی نیز باکتری‌های اسید استیک تخریب می‌شوند و درنتیجه PH بالا می‌رود و در مرحله بعد میکروارگانیسم‌های فاسد کننده شروع به فعالیت می‌کنند و قارچ‌های تولیدکننده توکسین‌ مثل آسپرژیلوس فلاووس در این مرحله شروع به رشد و تولید سم می‌کنند (Nout et al, 1993) .

به نظر می‌رسد که نگاهداری سیلو در فازهای ۲ و ۳ با استفاده از افزودنیها و کاهش اکسیژن در هنگام سیلوکردن محصول، باعث جلوگیری از فساد قارچی و تولید سم خواهد شد.(Ste Fanie J. W. H. Oude Elferin Ketae. 2000) .

خصوصیات بیولوژیکی و مورفولوژیکی Aspergillus Flavus
آسپرژیلوس فلاووس متعلق به جنس آسپرژیلوس است که دومین گونه متداول بعد از آسپرژیلوس فومیگاتوس می‌باشد. کلنی‌های A. flavus سریع رشد می‌کنند و قطر کلنی آنها به cm 7-6 در ۱۴-۱۰ روز می‌رسد. رنگ کلنی در ابتدا زرد است و سپس به زرد متمایل به سبز یا سبز زیتونی تبدیل می‌شود.

کلنی‌های قدیمی سبز تیره می‌شوند. شکل کلنی‌ها صاف است و بعضی دارای چروک‌های شعاعی‌اند. پشت کلنی بدون رنگ و یا به رنگ کرم است. محیط افتراقی، A. flavus , parasiticus آگار (AFPB) است که برای غربالگری و شناسایی گونه‌های A. flavus طراحی شده است. I- Pitt , A.D.Hocking , 1985; H.Govrama , L.B.Bullerman ,1995 A.parasiticus , A. Flavas در این محیط با تولید اسپورهای تیپیک زرد تا سبز زیتونی و پشت کلنی نارنجی روشن، متمایز می‌شوند.

(K. B. Raper, (D.I.Fennell,1965) . جزئیات بیشتر را می توان زیر میکروسکوپ الکترونی اسکنینک (SEM) دید: کنیدیوسپورها بلند هستند ( ۸۰۰ -۴۰۰) و اغلب ظاهری سخت درست در کنار وزیکول‌های کروی دارد (۲۵۳-۲۴). فیلایدها به شکل پیرامونی بلند شده‌اند و در دو ردیف قرار دارند و بعضی اوقات تک ردیفی هستند؛

شکل سرهای کنیدیال از ستونی تا شعاعی و کروی متغیر است؛ طرز قرارگیری فیلایدها بر روی وزیکول شکل سرکنیدیال را تعیین می‌کند. قطر آنها بین ۶۵ -۱۰ متغیر است (J.I.PiH & A.D.Hocking 1985) کنیدی‌ها از جدایی‌های A. flavus صاف تا کمی خشن هستند، در حالیکه کنیدی‌ها از A. Parasiticus خشن هستند. گونه‌های خاصی تولید اسکلروتیای قهوه‌ای می‌کنند.

گونه‌های آسپرژیلوس فلاووس در خاک وجود دارند و طیف وسیعی از محصولات کشاورزی را در مزرعه‌ محل‌های نگهداری و نیز در طی فرآوری‌ و توزیع آلوده می‌کنند. Aspergillus Flavus زیرگونه A. bombycis , A.tamarii, A. nomius, Parasiticus تنها قارچهایی هستند که تولید آفلاتوکسین در آنها نشان داده شده است (C. P.Kurtmon, 1987 S. W. peterson, Y.Ito, B.W.Horn, T.Go to 2001; C.W.Hesseltin, B.W.Horn ).

سویه های آسپرژیلوس فلاووس دارای انواع غیرسم‌زا و تولید کننده‌های آفلاتوکسین (B1 , B2, ) می‌باشد که در این بین A. Flavus زیرگونه پارازیتیکوس، آفلاتوکسین‌های B1, B2, G1, G¬۲٫ (AFG2, AFG1,AFB1, AFB2 ) را تولید می‌کند و جدایی‌های غیرسم‌زایی که آفلاتوکسین تولید نمی‌کنند در طبیعت نادر است (Du sanee Thanaboripat, Yang Qian, Lliu Ruigian, 2001)

تولید آفلاتوکسین
آفلاتوکسین‌ها گروهی از سم‌ها هستند که ساختار مولکولی مشابهی دارند. این توکسین برای اولین بار در سال ۱۹۶۰ وقتی که مرگ تعداد زیادی از بوقلمون‌های انگلیسی بر اثر بیماری کبدی روی داد، کشف شد. در آن سال بیش از صدهزار بوقلمون در طول چند ماه از بین رفتند.

(M. J. Carlie, S.C.Watkinson. G.W.Gooday. 2001) دانشمندان ابتدا این بیماری جدید را “بیماری X بوقلمون” نامیدند زیرا دلیل اصلی آن را نمی‌دانستند.

در نهایت معلوم شد که همه پرندگان آسیب دیده با غذایی که با آرد بادام زمینی آلوده شده تهیه شده بود، تغذیه شده بودند. آزمایش آرد بادام زمینی مشکوک، وجود قارچ را به اثبات رساند (E. Moore- landecker , 1996) اصلی‌ترین آلودگی میکروبی مشاهده شده در آرد بادام زمینی، Aspergillus Flavus بود و سم تولید شده توسط آن آفلاتوکسین نامیده شد. تا به امروز، آفلاتوکسین به عنوان مضرترین مایکوتوکسین در دنیا شناخته شده است.

مولکول آفلاتوکسین حاوی هسته کورماین (Courmarin) متصل شده به یک بی‌فوران (bifuran) و یا به یک پنتانون است مثل AFB2 , AFB1 مشتق دی‌هیدرو، یا به یک لاکتون ششی جزئی مثل AFG1 و مشتق آن AFG2 متصل است (P.Sanz , R. Reig and J.Piguers et al. 1989). این چهار ترکیب با رنگ فلورسانسی که تحت تابش اشعه ماوراء بنفش موج بلند، از خود نشان می‌دهند از هم متمایز می‌شوند .

(G Green; Bs blue) Hon(M.F.Dutton & J.G.Heathcote, 1966) تعیین آنها مربوط می‌شود به حرکت نسبی کروماتوگرافی آنها. از بین این چهار تا، B1 دارای بیشترین غلظت است که بعد از آن G2 , G1 قرار دارند. آسپرژیلوس فلاووس تنها B1 , B2 را تولید می‌کند و A.Parasiticus علاوه بر این متابولیت‌ها، G2 ,G1 را هم تولید می کند. Dutton & Heathcote مشتق‌های همی‌استال G1, B1 را به نام‌های B2a و G2a شناسایی کردند (M. F. Dutton , J. G. Heathcote , 1966). مشتق‌های ۴- هیدروکسیلات این دو توکسین اخیر در ذرت و بادام زمینی یافت شده است.

مشتق‌های AFM1 , AFM2 اول در شیر گاوهایی که با غذای آلوده به آفلاتوکسین تغذیه شده بودند، دیده شدند. سایر آفلاتوکسین‌های کوچک دیگر هم توسط A. flavus در محیط کشت و کبد و نیز احتمالاً در سایر اندام‌ها تولید می‌شوند. تولید آفلاتوکسین نتیجه ترکیبی از محیط و سوبسترا و گونه‌ها است. فاکتورهایی که بر تولید آفلاتوکسین مؤتراند را می‌توان به سه گروه تقسیم کرد: فاکتورهای فیزیکی، غذایی و بیولوژیکی.

فاکتورهای فیزیکی شامل دما، PH، رطوبت، نور، هوادهی و درجه گازهای اتمسفری می‌باشد. آفلاتوکسین‌ها بین دمای C ْ۱۲ تا ۴۲ تولید می‌شوند و دمای بهینه Cْ۳۵-۲۵ است (N. D. Davis , U. L. Diener , 1966). تولید ‎آفلاتوکسین در سیلوهای ذرت %۲۵ در Cْ۳۰ است و پایین‌ترین رطوبت نسبی برای تولید آفلاتوکسین بین %۸۸ و %۸۳ متفاوت است. حضور CO2 و O2 بر رشد قارچ و تولید آفلاتوکسین اثر می‌گذارد. وجود %۲۰ CO2 در جو، تولید آفلاتوکسین و رشد قارچ را به طور واضح کم می‌کند.

کاهش در مقدار O2 جو تا %۱۰ تولید آفلاتوکسین را تحت تأثیر قرار می‌دهد، اما تنها در مقادیر O2 کمتر از %۱ رشد قارچ و تولید آفلاتوکسین به طور کامل بازداشته می‌شود (U. L. Diener , N. D. Davis , K. E. landers, 1967). بسیاری نشان داده‌اند که PH اولیه به طور مشخص بر تولید آفلاتوکسین اثر گذار نیست،

در حالیکه تحقیقات دیگر نشان داده است که PH اسیدی ضعیف سبب افزایش تولید آفلاتوکسین می‌شود و به طور واضح رشد قارچ را تحت تأثیر می‌گذارد (B. Jarvis , 1971). هر کدام از محیط‌های آزمایشگاهی و طبیعی، تأثیر بارزی بر تولید آفلاتوکسین می‌گذراند. عموماً منبع‌ کربن ارجح برای تولید آفلاتوکسین، گلوکز، ساکارز یا فروکتوز است.

منیزیم و روی برای بیوسنتز آفلاتوکسین ضروری است، اما ترکیبی از آهن و کادمیوم رشد قارچ و در نتیجه تولید سم را کاهش می‌دهند.

برای به دست آوردن روشهای مؤثر جهت جلوگیری از آلودگی غذا با آ‏فلاتوکسین، آشکار شدن مکانیسم بیوسنتز آفلاتوکسین در گونه‌های A.Flavus بسیار مهم است (به محض اینکه اولین ژن در سال ۱۹۹۲ جدا شد و مورد شن